Рефераты

Химия наследственности. Нуклеиновые кислоты. ДНК. РНК. Репликация ДНК и передача наследственной информации

Методы, используемые для экстракции рибонуклеиновых кислот, частично

зависят от природы органа или организма. В одном из ранних методов,

использованном Левиным, к густому тесту из дрожжей добавляли щелочь, смесь

перемешивали с пикриновой кислотой, фильтровали и нуклеиновую кислоту

осаждали из фильтрата добавлением соляной кислоты. Такая довольно жесткая

обработка приводила к тому, что полученная нуклеиновая кислота значительно

отличалась от «нативной» рибонуклеиновой кислоты. Для выделения

рибонуклеиновых кислот, приближающихся по структуре к нуклеиновым кислотам

живой клетки, необходимо избегать применения жестких условий (рН,

температура) в то же время необходимо, насколько возможно, затормозить

ферментативный распад. Широко применялась экстракция рибонуклеопротеидов

изотоническим раствором хлористого натрия. Белки от нуклеиновых кислот

могут быть отщеплены различными методами, такими, как обработка смесями

хлороформа с октиловым спиртом, додецилсульфатом натрия, нитратом стронция

или спиртом, а также расщепление белковой фракции трипсином. И снова

эффективность каждого метода определяется природой рибонуклеопротеида. Для

инактивации ферментов в процессе экстракции полезно применение хлоргидрата

гуанидина (денатурирующего агента); для выделения рибонуклеиновых кислот и

нативных рибонуклеопротеидов из дрожжей был применен метод, использующий

адсорбцию рибонуклеаз на бентоните после предварительной обработки ионами

цинка.

Особые преимущества имеет выделение рибонуклеиновых кислот из

гомогенатов тканей млекопитающих, микроорганизмов и вирусов экстракцией

фенолом и водой при комнатной температуре, так как при этом белки и

дезоксирибонуклеиновые кислоты выпадают в осадок, активность рибонуклеазы

подавляется и высокополимерные продукты могут быть получены с хорошими

выходами. Прямая экстракция дрожжей водным раствором фенола была применена

для препаративного получения транспортных РНК.

5.5. Фракционирование

Помимо ряда вирусных нуклеиновых кислот, большинство выделенных

полирибонуклеотидов, бесспорно, представляют собой сложные смеси,

содержащие полимеры с различной длиной цепи, нуклеотидной

последовательностью и составом оснований (присутствие или отсутствие

«минорных» оснований). Существует ряд приемов для частичного

фракционирования, однако, пока не разработаны удовлетворительные методы

характеристики, трудно определить степень чистоты или гомогенности

рибонуклеиновых кислот. В основу оценки чистоты транспортных РНК, этих

сравнительно низкомолекулярных полирибонуклеотидов, может быть положена их

ферментативная реакция с аминокислотами (через аминоациладенилаты), что,

конечно, позволяет оценить и их биохимическую однородность.

Методы фракционирования включают осаждение нейтральными солями,

электрофорез, хроматографию на фосфате кальция и осаждение

днгидрострептомицином. Недавно для фракционирования рибонуклеиновых кислот

была использована фракционная диссоциация комплексов нуклеиновая кислота —

гистон, примененная ранее к дезоксинуклеиновым кислотам. Во всех фракциях

отношение 6-амино- к 6-кетонуклеозидам было близко к единице. В некоторой

степени фракционирование происходит при экстракции фенолом, возможно как

результат дифференциального связывания нуклеиновых кислот с белками.

Анионообменные целлюлозы, такие как ЭКТЕОЛА и ДЭАЭ, широко применяются в

настоящее время для фракционирования не только рибонуклеиновых кислот,

включая специфичные для аминокислот транспортные РНК, но и

рибонуклеопротеидов и даже вирусных препаратов. Для элюирования обычно

используют растворы нейтральных или близких к нейтральным солеи.

Поразительной особенностью метода является способность этих ионообменников

к разделению очень широкого спектра веществ, начиная от изомеров

мононуклеотидов и олигонуклеотидов с различной длиной цепи или различного

состава и кончая полинуклеотидами чрезвычайно высокого молекулярного веса.

Опубликовано сообщение о разделении на колонках из ДЭАЭ-декстрана РНК,

меченной валином, от немеченой акцепторной РНК. Для фракционирования

рибонуклеиновых кислот были также применены модифицированные ионообменные

целлюлозы, в которых к целлюлозе с помощью эпихлоргидрина присоединены

нуклеозиды (вместо триэтаноламина), особенно аденозин и гуанозин. Подобное

использование ЭКТЕОЛА-целлюлозы для фракционирования или выделения

информационной РНК, связанной в данный момент с ДНК, основано на

способности к специфическому образованию водородных связей: ЭКТЕОЛА

связывает денатурированную ДНК данного организма (для элюирования ДНК

необходим растворитель чрезвычайно высокой ионной силы), а информационная

РНК элюируется растворами понижающейся ионной силы. Посредством

хроматографии на трет-аминоалкилированном крахмале транспортная

рибонуклеиновая кислота была разделена на фракции на основании повышенного

сродства к тирозину и лейцину. Хроматография на оксиапатите дает хорошее

разделение рибонуклеиновых кислот, специфичных для валина и фенилаланина.

В другом методе, имеющем значительную потенциальную ценность,

используется поперечно сшитый полидиазостирол, полученный в результате

реакции полиаминостирола с азотистой кислотой; метод основан на

наблюдениях, что соединения дназония легко реагируют с некоторыми

аминокислотами с образованием ковалентно связанных производных. В пределах

рН от 7 до 8,5 быстро реагируют только тирозин и гистидин. Препараты

транспортных РНК, полностью этерифицированные аминокислотами, встряхивали с

нерастворимым полидиазостиролом, который реагировал только с нуклеиновыми

кислотами, меченными тирозином и гистидином.

[pic]

Дальнейшая очистка достигалась повторной этерификацией тирозином при

использовании очищенного тирозин-активнрующего фермента и повторной

обработкой полидиазостиролом. С неэтерифицированной специфичной к гистидину

рибонуклеиновой кислотой реакции не происходило, и она оставалась в

растворе, в то время как специфичная к тирозину нуклеиновая кислота

освобождалась, как и прежде, при обработке щелочью в мягких условиях. Обе

фракции получены почти чистыми в отношении их аминокислотоакцепторной

специфичности. Предварительные наблюдения показали, что специфичная к

валину рибонуклеиновая кислота, вполне вероятно, может быть этерифицирована

дипептидом тирозилвалином.

6. ПРИРОДА МЕЖНУКЛЕОТИДНЫХ СВЯЗЕЙ

Работы по определению способа соединения нуклеотидов в полимерных

молекулах НК были успешно завершены в начале 50-х годов сразу после того,

как была установлена структура нуклеотидов и изучены некоторые свойства их

производных (главным образом эфиров). К этому же времени были разработаны

методы выделения и очистки ДНК и РНК, так что исследование природы

межмономерных связей проводилось с использованием чистых, хотя и сильно

деградированных препаратов НК.

Первые сведения о типе межмономерной, или, как ее принято называть,

межнуклеотидной связи были получены с помощью потенциометрического

титрования. Эти сведения свидетельствовали о наличие как в РНК, так и в ДНК

только одной гидроксильной группы у каждой фосфатной группы. На основании

этого было сделано заключение, что НК содержит структурную единицу

дизамещенной фосфорной кислоты.

Естественно было предположить, что фосфатные остатки «сшивают»

нуклеозиды за счет двух своих гидроксилов, а один остается свободным.

Оставалось выяснить, какие части нуклеозидных фрагментов участвуют в

образовании связи с фосфатными группами.

Поскольку НК могут быть дезаминированы действием азотистой кислоты,

очевидно, что аминогруппы пиримидиновых и пуриновых оснований не принимают

участия в образовании межнуклеотидной связи. Помимо этого

потенциометрическое титрование указывало, что и оксо(окси)-группы остатков

гуанина и урацила, входящих в состав НК, свободны. На основании этих данных

было сделано заключение о том, что межнуклеотидные связи образованы

фосфатной группой и гидроксильными группами углеводных остатков (т. е. что

они являются фосфодиэфирными), которые, следовательно, и являются

ответственными за образование полимерной цепи (НК). Таким образом, то, что

принято обычно называть межнуклеотидной связью, представляет собой по

существу узел, включающий систему связей:

[pic]

(где С — первичный или вторичный атомы углерода остатка углевода). При

гидролизе ДНК и РНК в зависимости от условий реакции, образуются нуклеотиды

с разным положением фосфатного остатка:

[pic]

Если предположить, что в НК все межнуклеотидные связи идентичны, то,

очевидно, что они могут включать помимо фосфатного остатка только З'-

гидроксильную группу одного нуклеозидного звена и 5'-гидроксильную группу

другого нуклеозидного звена (3'—У-связь). В случае же их неравноценности в

полимерной цепи ДНК могли бы одновременно существовать три типа связей:

3'—5', 3'—3' и 5'—5'. Для РНК за счет участия 2/-гидpoкcилыIoй группы число

типов связи должно было быть еще больше.

Установить истинную природу межнуклеотидных связей в нативных ДНК и

РНК удалось в результате направленного расщепления биополимеров с помощью

химического и ферментативного гидролиза и последующего выделения и

идентификации полученных при этом фрагментов.

6.1. Межнуклеотидная связь в ДНК

Химический гидролиз ДНК с целью установления природы межнуклеотидной

связи оказался практически непригодным. ДНК не расщепляется при щелочных

значениях рН, что хорошо согласуется с предположением о фосфодиэфирной

природе межнуклеотидной связи. При обработке кислотой даже в мягких

условиях ДНК расщепляется как по фосфодиэфирным, так и по N-гликозидным

связям, образованным пуриновыми основаниями. Вследствие этого расщепление

полимера протекает неоднозначно, но из продуктов кислотного гидролиза ДНК

все же удалось выделить дифосфаты пиримидиновых дезоксинуклеозидов, которые

оказались идентичными синтетическим 3',5'-дифосфатам дезоксицитидина и

дезокситимидина:

[pic]

Здесь же важно отметить, что наличие этих соединений в продуктах

деградации ДНК указывает на участие обеих гидроксильных групп, по крайней

мере пиримидиновых мономерных компонентов, в образовании межнуклеотидной

связи.

Более специфическим оказалось ферментативное расщепление ДНК. При

обработке препаратов ДНК фосфодиэстеразой (ФДЭ) змеиного яда полимер

практически полностью гидролизуется до дезоксинуклеозид-5'-фосфатов,

структура которых была установлена сравнением с соответствующими

нуклеотидами, полученными встречным синтезом.

[pic]

Эти данные свидетельствуют об участии 5'-гидроксильных групп всех

четырех дезоксинуклеозидов, входящих в состав ДНК, в образовании

межнуклеотидной связи. Аналогично, но до 3'-фосфатов дезоксинуклеозидов

расщепляется ДНК в присутствии ФДЭ, выделенной из микрококков или из

селезенки.

[pic]

Из данных гидролиза ДНК фосфодиэстеразами различной специфичности

становится очевидным, что связь нуклеозидных остатков в ДНК осуществляется

фосфатной группой, которая одновременно этерифицирует гидроксильную группу

у вторичного атома углерода (положение 3') одного нуклеозидного звена и

гидроксильную группу у первичного атома углерода (положение 5') - другого

нуклеотидного звена.

Таким образом, было убедительно доказано, что в ДНК межнуклеотидная

связь осуществляется за счет фосфатной группы, а также 3'- и 5'-

гидроксильных групп нуклеозидных остатков [(а) и (б) — направления

расщепления полинуклеотидной цепи ДНК фосфодиэстеразами соответственно

змеиного яда и селезенки или микрококков]:

[pic]

Предположение о возможности иного строения полимера с регулярно

перемежающимися связями нуклеозидных остатков по типу 3'—3' и 5'—5' было

отвергнуто, так как оно не удовлетворяло всем экспериментальным данным.

Так, полимер такого типа не должен был бы полностью гидролизоваться (до

мономеров) в присутствии ФДЭ змеиного яда, избирательно расщепляющей только

алкиловые эфиры нуклеозид-5' –фосфатов. То же можно сказать о ФДЭ

селезенки, селективно гидролизирующей алкиловые эфиры нуклеозид-3'-

фосфатов.

6.2. Межнуклеотидная связь в РНК

Более сложным оказался вопрос о природе межнуклеотидной связи в РНК.

Уже на первых этапах изучения строения РНК был установлен факт чрезвычайной

неустойчивости се при щелочном гидролизе. Основными продуктами щелочного

гидролиза РНК являются рибонуклсозид-2'- и рибонуклеозид-З'-фосфаты,

образующиеся практически в равных количествах.

[pic]

Рибонуклеозид-5'-фосфаты при этом не образуются. Эти данные не

укладывались в представления о фосфодиэфирной природе межнуклеотидной связи

в РНК и требовали всестороннего изучения. Очень важную роль в таком

исследовании, которое выполнили в начале 50-х гг. Тодд с сотрудниками,

сыграли синтетические алкиловые эфиры рибонуклеотидов, которые были

получены специально, чтобы промоделировать тот или иной тип фосфодиэфирной

связи.

Полученные школой Тодда данные о механизмах превращения алкиловых

эфиров рибонуклеотидов в щелочной среде позволили предположить, что в РНК,

так же как и в ДНК, межнуклеотидная связь осуществляется фосфатной группой

и 3'- и 5'-гидроксильными группами углеводных остатков. Подобная связь в

РНК должна очень легко расщепляться в щелочной среде, так как соседняя 2'-

гидроксильная группа должна катализировать этот процесс при рН>10, когда

начинается ионизация гидроксильных групп рибозы. Очень важно подчеркнуть,

что промежуточными соединениями при щелочном расщеплении должны быть все

четыре рибонуклеозид-2',З'-циклофосфата, а конечными — образующиеся при их

гидролизе рибонуклеозид-3'-фосфаты и рибонуклеозид-2'-фосфаты (четыре пары

изомеров).

Данные щелочного гидролиза ограничили количество возможных для РНК

типов межнуклеотидных связей, но не прояснили вопроса о том, как построен

этот полимер.

Более точные сведения о типе межнуклеотидной связи в РНК, как и в

случае ДНК, были получены с помощью ферментативного гидролиза.

Гидролиз РНК с использованием ФДЭ змеиного яда, протекающий до

рибонуклеозид-5'-фосфатов, подтвердил уже прямым путем предположение об

участии 5'-гидроксильных групп в образовании фосфодиэфирной связи между

мономерными звеньями. Позднее это было окончательно установлено в

результате открытия фосфоролиза РНК в присутствии фермента

полинуклеотидфосфорилазы (ПНФаза), приводящего к образованию рибонуклеозид-

5'-пирофосфатов:

[pic]

Таким образом, оставалось выяснить природу второй гидроксильной

группы, участвующей в образовании межнуклеотидной связи. Частично решить

эту задачу помог еще один фермент, который использовался для направленного

расщепления РНК, — пиримидиловая рибонуклеаза (РНаза).

Ранее было показано, что этот фермент расщепляет только алкиловые

эфиры пиримидиновых рибонуклеозид-3'-фосфатов до рибонук-леозид-3'-фосфатов

(через промежуточный рибонуклеозид-2',З'-циклофосфат). Оказалось, что

аналогичным образом этот фермент действует и на РНК. В экспериментах с

любыми образцами очищенной РНК было обнаружено, что количество фосфорной

кислоты, которая образуется при обработке полимера последовательно

пиримидиловой РНазой и фосфомоноэстеразой (ФМЭ), а также количество иодной

кислоты, затрачиваемой на последующее окисление, эквивалентно количеству

остатков пиримидинов в данном образце РНК. Это говорило в пользу того, что

по крайней мере пиримидиновые нуклеотиды в РНК связаны с соседними

нуклеотидами только посредством 3'—5'-межнук-леотидной связи. Этот вывод

подтверждают данные щелочной обработки ферментативных гидролизатов РНК,

полученных после действия на нее РНазы: в щелочной среде миграция

фосфатного остатка в рибонуклеозид-З'- и -2'-фосфатах невозможна, и наличие

в соответствующих гидролизатах только пиримидиновых рибонуклеозид-З'-

фосфатов делает очевидным 3'—5'-тип межнуклеотидной связи для пиримидиновых

нуклеотидов.

7. МАТРИЧНЫЙ СИНТЕЗ ДНК

Способность клеток поддерживать высокую упорядоченность своей

организации зависит от генетической информации, которая сохраняется в форме

дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). ДНК - это вещество, из которого

состоят гены. Размножение живых организмов, передача наследственных свойств

из поколения в поколение и развитие многоклеточного организма из

оплодотворенной яйцеклетки возможны потому, что ДНК способна к

самовоспроизведению. Сам процесс самовоспроизведения ДНК называется

репликацией. Иногда используют также название-синоним - редупликация.

Как известно, генетическая информация записана в цепи ДНК в виде

последовательности нуклеотидных остатков, содержащих одно из четырех

гетероциклических оснований: аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) и тимин

(T). Предложенная Дж. Уотсоном и Ф. Криком в 1953 году модель строения ДНК

в форме регулярной двойной спирали сразу же позволила понять принцип

удвоения ДНК. Информационное содержание обеих цепей ДНК идентично, так как

каждая из них содержит последовательность нуклеотидов, строго

соответствующую последовательности другой цепи. Это соответствие

достигается благодаря наличию водородных связей между направленными

навстречу друг другу основаниями двух цепей - попарно G и C или A и T.

Описывая это свойство двойной спирали, молекулярные биологи говорят, что

цепи ДНК комплементарны за счет образования уотсон-криковских пар GРC и

AРT.

Поскольку две цепи имеют противоположную направленность, их называют

антипараллельными. Легко представить, что удвоение ДНК происходит

вследствие того, что цепи расходятся, а потом каждая цепь служит матрицей,

на которой собирается комплементарная ей новая цепь ДНК. В результате

образуются две дочерние, двуспиральные, неотличимые по строению от

родительской ДНК молекулы. Каждая из них состоит из одной цепи исходной

родительской молекулы ДНК и одной вновь синтезированной цепи. Такой

механизм репликации ДНК, при котором от одного поколения к другому

передается одна из двух цепей, составляющих родительскую молекулу ДНК,

получил название полуконсервативного и был экспериментально доказан в 1958

году М. Мезельсоном и Ф. Сталь.

Кроме того, ситезу ДНК характерны такие свойства, как

антипараллельность и униполярность. Каждая цепь ДНК имеет определенную

ориентацию. Один конец несет гидроксильную группу (ОН), присоединенную к 3'-

углероду в сахаре дезоксирибозе, на другом конце цепи находится остаток

фосфорной кислоты в 5'-положении сахара. Две комплементарные цепи в

молекуле ДНК ориентированы в противоположных направлениях - антипараллельно

(при параллельной ориентации напротив 3'-конца одной цепи находился бы 3'-

конец другой). Ферменты, синтезирующие новые нити ДНК, называемые ДНК-

полимеразами, могут передвигаться вдоль матричных цепей лишь в одном

направлении - от их 3'-концов к 5'-концам. При этом синтез комплементарных

нитей всегда ведется в 5' 3' направлении, то есть униполярно. Поэтому в

процессе репликации одновременный синтез новых цепей идет антипараллельно.

ДНК-полимеразы могут давать "задний ход", то есть двигаться в

направлении 3' 5'. В том случае, когда последнее добавленное при синтезе

нуклеотидное звено оказалось некомплементарным нуклеотиду матричной цепи,

оно будет замещено комплементарным нуклеотидом. Отщепив "неправильный"

нуклеотид, ДНК-полимераза продолжает синтез в 5' 3' направлении. Такая

способность к исправлению ошибок получила название корректорской функции

фермента.

7.1. ДНК-полимеразы

В 1957 году А. Корнберг обнаружил у кишечной палочки фермент,

катализирующий процесс полимеризации ДНК из нуклеотидов; он был назван ДНК-

полимеразой. Затем ДНК-полимеразы выявили и в других организмах. Было

показано, что субстратами всех этих ферментов служат

дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ), полимеризующиеся на одноцепочной ДНК-

матрице. ДНК-полимеразы последовательно наращивают одноцепочную цепь ДНК,

шаг за шагом присоединяя к ней следующие звенья в направлении от 5-' к 3'-

концу, причем выбор очередного дНТФ диктуется матрицей. Присоединение

каждого нового нуклеотидного остатка к 3'-концу растущей цепи

сопровождается гидролизом богатой энергией связи между первым и вторым

фосфатными остатками в дНТФ и отщеплением пирофосфата, что делает реакцию в

целом энергетически выгодной.

В клетках обычно присутствует несколько типов ДНК-полимераз,

выполняющих различные функции и имеющих разное строение. Они могут быть

построены из различного количества белковых цепей (субъединиц), от одной до

десятков, однако все они работают на любых последовательностях нуклеотидов

матрицы. Задача этих ферментов - сделать точную копию каждой матрицы.

7.2. Точность синтеза ДНК и механизм коррекции

Генетический материал живых организмов имеет огромные размеры и

реплицируется с высокой точностью. В среднем в процессе воспроизведения

генома млекопитающего, состоящего из ДНК длиной 3 миллиарда пар

нуклеотидов, возникает не более трех ошибок. При этом ДНК синтезируется

чрезвычайно быстро: скорость ее полимеризации колеблется в пределах от 500

нуклеотидов в секунду у бактерий, до 50 нуклеотидов в секунду у

млекопитающих).

Высокая точность репликации, наряду с ее высокой скоростью,

обеспечивается наличием специальных механизмов, осуществляющих коррекцию,

то есть устраняющих ошибки. Суть механизма коррекции заключается в том, что

ДНК-полимеразы дважды проверяют соответствие каждого нуклеотида матрице:

один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед

тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь

синтезируется лишь в том случае, если последний (3'-концевой) нуклеотид

растущей цепи ДНК образовал правильную уотсон-криковскую пару с

соответствующим нуклеотидом матрицы. Если же на предыдущей стадии реакции

произошло ошибочное спаривание оснований, то дальнейшая полимеризация

останавливается до тех пор, пока ошибка не будет исправлена. Для этого

фермент перемещается в обратном направлении и вырезает последнее

добавленное звено, после чего его место может занять правильный

нуклеотидпредшественник. Иными словами, многие (но не все) ДНК-полимеразы

обладают, помимо 5'-3'-синтетической активности, еще и 3'-гидролизующей

активностью, которая обеспечивает удаление ошибочно спаренных с матрицей

нуклеотидов.

8. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ РЕПЛИКАЦИИ

Основные правила, в соответствии с которыми происходит репликация,

были выяснены в опытах с бактериями, однако они справедливы также и для

высших организмов.

8.1. Инициация цепей ДНК

ДНК-полимеразы не могут начинать синтеза ДНК на матрице, а способны

только добавлять новые дезоксирибонуклеотидные звенья к 3'-концу уже

имеющейся полинуклеотидной цепи. Такую заранее образованную цепь, к которой

добавляются нуклеотиды, называют затравкой. Короткую РНК- затравку

синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов фермент, не обладающий

корректирующей активностью и называемый ДНК-праймазой (от англ. primer -

затравка). Праймазная активность может принадлежать либо отдельному

ферменту, либо одной из субъединиц ДНК-полимеразы. Затравка,

синтезированная этим неточным ферментом, не умеющим исправлять ошибки,

отличается от остальной новосинтезированной цепи ДНК, поскольку состоит из

рибонуклеотидов, и далее может быть удалена.

Размер рибонуклеотидной затравки невелик (менее 20 нуклеотидов) в

сравнении с размером цепи ДНК, образуемой ДНК-полимеразой. Выполнившая свою

функцию РНК-затравка удаляется специальным ферментом, а образованная при

этом брешь заделывается ДНК-полимеразой, использующей в качестве затравки

3'-ОН-конец соседнего фрагмента. Удаление крайних РНК-праймеров,

комплементарных 3'-концам обеих цепей линейной материнской молекулы ДНК,

приводит к тому, что дочерние цепи оказываются короче на 10-20 нуклеотидов

(у разных видов размер РНК-затравок различен). В этом заключается так

называемая "проблема недорепликации концов линейных молекул". В случае

репликации кольцевых бактериальных ДНК этой проблемы не существует, так как

первые по времени образованиЯ РНК-затравки удаляются ферментом, который

одновременно заполняет образующуюся брешь путем наращивания 3'-ОН-конца

растущей цепи ДНК, направленной в "хвост" удаляемому праймеру. Проблема

недорепликации 3'-концов линейных молекул ДНК решается эукариотическими

клетками с помощью специального фермента - теломеразы. В 1985 году он был

обнаружен у равноресничной инфузории Tetrahymena thermophila, а

впоследствии - в дрожжах, растениях и животных, в том числе в яичниках

человека.

Теломераза является ДНК-полимеразой, достраивающей 3'-концы линейных

молекул ДНК хромосом короткими (6-8 нуклеотидов) повторяющимися

последовательностями (у позвоночных TTAGGG). Согласно номенклатуре, этот

фермент называют ДНК- нуклеотидилэкзотрансферазой или теломерной

терминальной трансферазой. Помимо белковой части теломераза содержит РНК,

выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК повторами. Длина теломеразной

РНК колеблется от 150 нуклеотидов у простейших до 1400 нуклеотидов у

дрожжей, у человека - 450 нуклеотидов. Сам факт наличия в молекуле РНК

последовательности, по которой идет матричный синтез куска ДНК, позволяет

отнести теломеразу к своеобразной обратной транскриптазе, то есть ферменту,

способному вести синтез ДНК по матрице РНК.

В результате того что после каждой репликации дочерние цепи ДНК

оказываются короче материнских на размер первого РНК-праймера (10-20

нуклеотидов), образуются выступающие однонитевые 3'-концы материнских

цепей. Они-то и узнаются теломеразой, которая последовательно наращивает

материнские цепи (у человека на сотни повторов), используя 3'-ОН-концы их в

качестве затравок, а РНК, входящую в состав фермента, в качестве матрицы.

Образующиеся длинные одноцепочные концы, в свою очередь, служат матрицами

для синтеза дочерних цепей по традиционному репликативному механизму.

Постепенное укорочение ДНК хромосом во время репликации является

одной из теорий "старения" клеточных колоний. Еще в 1971 году отечественный

ученый А.М. Оловников в своей теории маргинотомии (от лат. marginalis

-краевой, tome - сечение) предположил, что это явление лежит в основе

ограниченного потенциала удвоения, наблюдаемого у нормальных соматических

клеток. Американский ученый Леонард Хейфлик в начале 60-х годов показал,

что если для культивирования взять клетки новорожденных детей, то они могут

пройти 80-90 делений, в то время как соматические клетки от 70-летних

делятся только 20- 30 раз. Ограничение на число клеточных делений и

называют лимитом Хейфлика.

8.2. Расплетение двойной спирали ДНК

Поскольку синтез ДНК происходит на одноцепочечной матрице, ему должно

предшествовать обязательное разделение (хотя бы на время) двух цепей ДНК.

Исследования, проведенные в начале 60-х годов на реплицирующихся

хромосомах, выявили особую, четко ограниченную область репликации,

перемещающуюся вдоль родительской спирали ДНК и характеризующуюся местным

расхождением двух ее цепей. Эта активная область из-за своей Y-образной

формы была названа репликационной вилкой. Именно в ней ДНК-полимеразы

синтезируют дочерние молекулы ДНК.

С помощью электронной микроскопии реплицирующейся ДНК удалось

установить, что область, которая уже реплицирована, имеет вид глазка внутри

нереплицировавшейся ДНК. Важно отметить, что репликационный глазок

образуется только в тех местах молекулы, где находятся специфические

нуклеотидные последовательности. Эти последовательности, получившие

название точек начала репликации, состоят приблизительно из 300

нуклеотидов. В зависимости от того, в одном или в двух направлениях

происходит репликация (а это зависит от природы организма), глазок содержит

одну или две репликационные вилки. Последовательное движение репликационной

вилки приводит к расширению глазка.

Двойная спираль ДНК весьма стабильна; для того чтобы она раскрылась,

необходимы особые белки. Специальные ферменты ДНК-хеликазы быстро движутся

по одиночной цепи ДНК, используя для перемещения энергию гидролиза ATФ.

Встречая на пути участок двойной спирали, они разрывают водородные связи

между основаниями, разделяют цепи и продвигают репликационную вилку. Вслед

за этим с одиночными цепями ДНК связываются специальные дестабилизирующие

спираль белки, которые не позволяют одиночным цепям ДНК сомкнуться. При

этом они не закрывают оснований ДНК, оставляя их доступными для спаривания.

Не следует забывать, что комплементарные цепи ДНК закручены друг

вокруг друга в спираль. Следовательно, для того чтобы репликационная вилка

могла продвигаться вперед, вся еще не удвоенная часть ДНК должна была бы

очень быстро вращаться. Эта топологическая проблема решается путем

образования в спирали своего рода "шарниров", позволяющих цепям ДНК

раскрутиться. Принадлежащие к особому классу белки, называемые ДНК-

топоизомеразами, вносят в цепь ДНК одно- или двух- цепочные разрывы,

позволяющие цепям ДНК разделиться, а затем заделывают эти разрывы.

Топоизомеразы участвуют также в расцеплении зацепленных двухцепочечных

колец, образующихся при репликации кольцевых двунитевых ДНК. С помощью этих

важных ферментов двойная спираль ДНК в клетке может принимать

"недокрученную" форму с меньшим числом витков; в такой ДНК легче происходит

расхождение двух цепей ДНК в репликационной вилке.

8.3. Прерывистый синтез ДНК

Легко вообразить, что репликация происходит путем непрерывного роста

нуклеотида за нуклеотидом обеих новых цепей по мере перемещения

репликационной вилки; при этом, поскольку две цепи в спирали ДНК

антипараллельны, одна из дочерних цепей должна была бы расти в направлении

5'-3', а другая в направлении 3'-5'. В действительности, однако, оказалось,

что дочерние цепи растут только в направлении 5'-3', то есть всегда

удлиняется 3'-конец затравки, а матрица считывается ДНК-полимеразой в

направлении 3'-5'.Это утверждение на первый взгляд кажется несовместимым с

движением репликационной вилки в одном направлении, сопровождающемся

одновременным считыванием двух антипараллельных нитей.

Разгадка секрета заключается в том, что синтез ДНК происходит

непрерывно только на одной из матричной цепей. На второй матричной цепи ДНК

синтезируется сравнительно короткими фрагментами (длиной от 100до 1000

нуклеотидов, в зависимости от вида), названными по имени обнаружившего их

ученого фрагментами Оказаки. Вновь образованная цепь, которая синтезируется

непрерывно, называется ведущей, а другая, собираемая из фрагментов Оказаки,

отстающей. Синтез каждого из этих фрагментов начинается с РНК-затравки.

Через некоторое время РНК-затравки удаляются, бреши застраиваются ДНК-

полимеразой и фрагменты сшиваются в одну непрерывную цепь ДНК специальным

ферментом.

8.4. Кооперативное действие белков репликационной вилки

До сих пор мы говорили об участии отдельных белков в репликации так,

как будто бы они работают независимо друг от друга. Между тем в

действительности большая часть этих белков объединена в крупный комплекс,

который быстро движется вдоль ДНК и согласованно осуществляет процесс

репликации с высокой точностью. Этот комплекс сравнивают с крошечной

"швейной машиной": "деталями" его служат отдельные белки, а источником

энергии - реакция гидролиза нуклеозидтрифосфатов. Спираль расплетается ДНК-

хеликазой; этому процессу помогают ДНК - топоизомераза, раскручивающая цепи

ДНК, и множество молекул дестабилизирующего белка, связывающихся с обеими

одиночными цепями ДНК.

В области вилки действуют две ДНК-полимеразы - на ведущей и отстающей

цепи. На ведущей цепи ДНК-полимераза работает непрерывно, а на отстающей

фермент время от времени прерывает и вновь возобновляет свою работу,

используя короткие РНК-затравки, синтезируемые ДНК-праймазой. Молекула ДНК-

праймазы непосредственно связана с ДНК-хеликазой, образуя структуру,

называемую праймосомой. Праймосома движется в направлении раскрывания

репликационной вилки и по ходу движения синтезирует РНК-затравку для

фрагментов Оказаки. В этом же направлении движется ДНК-полимераза ведущей

цепи и, хотя на первый взгляд это трудно представить, ДНК-полимераза

отстающей цепи. Для этого, как полагают, последняя накладывает цепь ДНК,

которая служит ей матрицей, саму на себя, что и обеспечивает разворот ДНК-

полимеразы отстающей цепи на 180 градусов. Согласованное движение двух ДНК-

полимераз обеспечивает координированную репликацию обеих нитей. Таким

образом, в репликационной вилке одновременно работают около двадцати разных

белков (из которых мы назвали только часть), осуществляя сложный,

высокоупорядоченный и энергоемкий процесс.

8.5. Согласованность процессов репликации ДНК и клеточного деления

Эукариотическая клетка перед каждым делением должна синтезировать

копии всех своих хромосом. Репликация ДНК эукариотической хромосомы

осуществляется посредством разделени хромосомы на множество отдельных

репликонов. Такие репликоны активируются не все одновременно, однако

клеточному делению должна предшествовать обязательная однократная

репликация каждого из них.

Из сказанного ясно, что по хромосоме эукариот в каждый момент времени

может двигаться независимо друг от друга множество репликационных вилок.

Остановка продвижения вилки происходит только при столкновении с другой

вилкой, движущейся в противоположном направлении, или по достижении конца

хромосомы. В результате вся ДНК хромосомы в короткий срок оказывается

реплицированной. После сборки на молекуле ДНК хромосомных белков каждая

пара хромосом в процессе митоза упорядоченно разделяется по дочерним

клеткам.

9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В моей работе я пыталась разобраться в такой проблеме, как

происхождение и продолжение жизни, и еще раз убедилась, что все нас

окружающее – это результат соединения в различной последовательностью

химических элементов. В процессе выполнения работы я все больше убеждалась,

что невозможно познать и объяснить загадку происхождения жизни без знания

органической химии. Неразрывно связана с химией и биология.

Почти полвека тому назад был открыт принцип структурной (молекулярной)

организации генного вещества – дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Структура ДНК дала ключ к механизму точного воспроизведения генного

вещества. Так возникла новая наука – молекулярная биология. Была

сформулирована так называемая центральная догма молекулярной биологии: ДНК

– РНК – белок. Смысл ее состоит в том, что генетическая информация,

записанная в ДНК, реализуется в виде белков, но не непосредственно, а через

посредство родственного полимера – рибонуклеиновую кислоту (РНК), и этот

путь от нуклеиновых кислот к белкам необратим. Таким образом, ДНК

синтезируется на ДНК, обеспечивая собственное воспроизведение исходного

генетического материала в поколениях; РНК синтезируется на ДНК, в

результате чего происходит переписывание, или транскрипция, генетической

информации в форму многочисленных копий РНК; молекулы РНК служат матрицами

для синтеза белков – генетическая информация транслируется в форму

полипептидных цепей. Итак, именно ДНК определяет наследственность

организмов, то есть воспроизводящийся в поколениях набор белков и связанных

с ними признаков. Биосинтез белка является центральным процессом живой

материи, а нуклеиновые кислоты обеспечивают его, с одной стороны,

программой, определяющей весь набор и специфику синтезируемых белков, а с

другой – механизмом точного воспроизведения этой программы в поколениях.

Следовательно, происхождение жизни в ее современной клеточной форме

сводится к возникновению механизма наследуемого биосинтеза белков.

10. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор – Биология.

2. З.А. Шабарова и А.А. Богданов – Химия нуклеиновых кислот и их полимеров.

3. А.П. Пехов – Биология и общая гинетика.

4. А. Микельсон – Химия нуклеозидов и нуклеотидов.

5. Гауптман, Ю. Грефе, Х. Ремане – Органическая химия.

6. Опарин А.И. Возникновение жизни на Земле (3-е изд.).

7. Альтштейн А.Д. Происхождение генетической системы: гипотеза прогенов

8. Б.А.Павлов, А.П.Терентьев «Курс органической химии».

Страницы: 1, 2


© 2010 Рефераты