Хроматографический метод – физико-химический метод разделения компонентов сложных смесей газов, паров, жидкостей или растворенных веществ, основанный на использовании сорбционных процессов в динамических условиях.

ОБРАЩЕННО-ФАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ОФХ, RP)

Сорбенты

Химически привитые впервые были применены в колоночной жидкостной хроматографии для получения гидрофобных распределительных систем. Поскольку в таких системах происходит «обращение» свойств фаз, т.е. неподвижная фаза становиться неполярной, а подвижная – полярной, то они получили название обращенно-фазовых систем.

Получают ОФ модифицированием поверхностных силанольных групп алкилхлорсиланами. Осуществить модифицирование всех поверхностных силанольных групп не представляется возможным (50%). Вместо монохлорсиланов применяют дихлорсиланы, однако, тогда не все хлорные группы могут прореагировать. Чтобы улучшить степень модифицированности колонки и избавиться от хлор групп колонку обрабатывают сильным силанизирующим агентом - триметилхлорсиланом. При такой обработке удается повысить спепень модификации силикагеля до 90%. Воспроизводимость величины степени покрытия поверхности остается хорошей до тех пор, пока используется одна и та же партия силикагеля. Поэтому ОФ колонки отличаются от партии к партии и от производителя к производителю.

Влияние привитых алкильных групп отражает термин «гидрофобная селективность». В первом приближении коэффициент емкости для данного разделяемого соединения увеличивается с увеличением связанного углерода на единицу объема колонки. Максимальное удерживание обеспечивает привитая октадецильная группа. Такие неподвижные фазы предпочтительны, если растворимость разделяемых веществ в водном элюенте ограничена. С18 характеризуется также высокой селективностью при разделении соседних членов гомологических рядов. В тоже время для разделения соединений, молекулы которых имеют большой размер, высокую гидрофобность и ограниченную растворимость в элюенте с высоким содержанием органических добавок, рекомендуется фаза с короткими привитыми цепями.

Растворители.

Элюотропный ряд обращается, наиболее часто используются растворители ацетонитрил, метанол, тетрагидрофуран, вода.

Коэффициент емкости увеличивается с увеличением содержания воды в элюенте. Выбор растворителя определяется растворимостью в нем вещества. С увеличение содержания органического компонента на 10% К уменьшается в три раза.

Изменить относительное удерживание при элюировании водно-метанольными растворами можно, добавляя в элюент второй органический компонент, например ТГФ. На обращенной фазе сорбируется неполярный компонент элюента и свойства получаемой фазы отличаются от исходной.

Если соединение диссоциирует на ионы, то у пиков на хроматограмме образуются образуются хвосты. Поэтому для лучшей формы пика при анализе кислотных соединений в элюент добавляют не более 1% кислоты, а для основных соединений – триэтиламин или соли.

Влияние структуры на удерживание.

В первом приближении можно принять, что удерживание возрастает с уменьшением растворимости соединения в воде, т.е. с уменьшением полярности. В гомологических рядах прибавление каждой метиленовой группы увеличивает время удерживания. Разветвленные раньше выходят, чем линейные. Насышщенные раньше, чем ненасыщенные

Сравним адсорбционную и ОФ хроматографии.

Равновесие в ОФ устанавливается быстрее, поэтому более приемлемые условия для проведения градиентного элюирования.

Возможность применения водных элюэнтов и анализировать вещества, расворенные в воде.

Срок службы колонок с привитыми фазами гораздо больше, чем у силикагельных колонок.

Многообразие модифицирующих реагентов по сравнению с адсорбционной хроматографией.

Вторичные равновесия на обращенной фазе.

Для разделения диссоциирующих соединений, кроме этого молекула должна быть не очень большой (например как аминокислоты, алкалоиды и т.д.), а соединение, выбранное в качестве противоиона должно обладать длинной насыщенной алкильной цепью (от четырех до десяти атомов углерода в цепочки)

В основу ион-парной хроматографии положены принципы классической экстнракции из водной в органическую фазу ионных веществ в виде ион-парных соединений. В водных элюентах противоионы и ионы разделяемых соединений образуют диссоциирующие ионные пары (в подвижной фазе), которые селективно удерживаются на неподвижной фазе и в результате разделяются. Если противоионы адсорбируются на неподвижной фазе, ионы разделяемых соединений взаимодействуют с ними, удерживаются и соответственно разделяются. Например, соединение, имеющее кислотную группу, будет сорбироваться в виде ионной пары с тетрабутиламмониевым ионом на сорбенте. В результате станет возможным увеличить удерживание анализируемого соединения.

Состав подвижной фазы, тип противоиона, рН, ионная сила элюента – варьирование этих параметров позволяет проводить оптимизацию условий разделения.

ГЕЛЬ-ПРОНИКАЮЩИЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ГПХ имеет в своей основе единый механизм разделения. В отсутствии спец взаимодействий пробы и неподвижной фазы порядок элюирования во всех случаях является функцией размера молекул. Для синтетических неразветвленных полимеров, существующих в растворе в виде статистического клубка, размеры молекул можно непосредственно связать с молекулярной массой. Это позволяет откалибровать колонку при помощи полистирольных стандартов, элюируя их дихлорметаном, а затем проводить на этой колонке разделение белков или водорастворимых полимеров, элюируя их водой или водными буферными растворами.

Мертвый объем в ГПХ определяется как объем элюирования молекул низкомолекулярного вещества, не взаимодействующего с сорбентаом, но проникающем во все поры, включая поры наименьшего диаметра. Мертвый объем складывается из объема неподвижной фазы и объема пор. Объем неподвижной фазы определяется как удерживаемый объем полностью исключенных молекул с большой средней молекулярной массой не проникающих в поры.

Сорбенты.

Устойчивость к химическим взаимодействиям, температуре и механическим воздействиям.

Широкие возможности варьирования проницаемости.

Однородная структура.

Не должны вступать в адсорбционные взаимодействия.

Сефадексы. Полиакриламидные гели, агарозные гели, полистиролы, силикатные сорбенты.

Растворители.

Должны растворять образец

Смачивать сорбент

недопускать адсорбции полимера на сорбенте.

ТГФ – универсальный растворитель,

Толуол – полиизопрены, силиконы,

ДМФА – полиамиды,

Водные буферные растворы – белки.

Оптимизация условий разделения.

Определить ММР для колонки по стандартному набору полистеролов и выбрать подходящую колонку или несколько колонок. Исключить ионные взаимодействия образца путем введения нейтральных солей в элюент.

ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Иониты представляют собой нерастворимые ВМС, содержащие способные к ионизации функциональные группы и дающие с ионами противоположного заряда нерастворимые соли. Уже давно известны неорганические иониты, для смягчения воды, и только с появлением синтетических органических ионитов процессы ионного обмена стали широко использоваться.

В зависимости от характера ионизирующих групп иониты подразделяют на катиониты и аниониты. Катиониты являются поливалентными нерастворимыми кислотами, образующими нерастворимые соли с катионами или обменивающими один катион на другой. Анионтиты представляют собой органические поливалентные основания, связывающие анионы.

Катионит-SO3H+ + NH4+ - Катионит-SO3NH4++ H+

Катионит-SO3NH4+ + Na+ - Катионит-SO3Na+ + NH4+

Анионит – NH+3 OH - + CH3COO - Анионит – NH+3CH3COO - + OH-

Анионит – NH+3CH3COO - + H+CL - Анионит – NH+3CL - + CH3COO-H+

В качестве ионизирующихся групп катиониты могут иметь ароматические сульфогруппы, фосфатные, карбоксильные группы или ароматический гидроксил. Если в ионите присутствуют ионизирующие группы нескольких типов (полифункциональные), то это не всегда благоприятно сказывается на процессе разделения. Наиболее часто применяются монофункциональные иониты. Способность ионита связывать ионы с противоположным знаком зависит от числа ионизирующихся групп. Емкость ионитов обычно выражают в виде числа миллиэквивалентов на 1гр сухого или на 1гр влажного ионита.

Cтепень сшивания является одной из важных характеристик ионитов. При увеличении степени сшивания ионита ионы в него проникают труднее, равновесие устанавливается медленнее, избирательность повышается, а сопсобность связывать большие ионы уменьшается. Скорость установления равновесия при хроматографии на ионите в значительной мере зависит от размеров частиц. Равновесие устанавливается быстрее в случае относительно небольших частиц, но вместе с тем на них сильнее проявляется нежелательная адсорбция, которая изменяет форму зон разделяемых веществ.

Степень связывания различных ионов ионитами в водных растворах можно оценить при помощи следующего правила. В случае катионитов сродство возрастает с увеличением валентности иона или при данной валентности с повышением его атомного (молекулярного) веса. В случае анионитов сродство прямо пропорционально силе или основности кислот.

В качестве элюентов используются буферные растворы, а чтобы исключить нежелательные гидрофобные взаимодействия в элюент добавляют метанол или ацетонитрил (не более 5%).

Оптимизация условий разделения.

Изменение рН.

Повышение ионной силы.

Изменение температуры.

Изменение состава буферного раствора.

РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

При распределительной хроматографии разделение осуществляется главным образом за счет коэффициентов распределения разделяемых веществ. Согласно закону Нернста, для определенного вещества и определенной системы фаз коэффициент распределения есть величина постоянная, не зависящая от концентрации вещества. Однако, воспроизводимость распределительной хроматографии сильно зависит от концентрации растворенного вещества. При низких концентрациях этим обстоятельством можно пренебречь, но при более высоких концентрациях закон Нернста не соблюдается (см. теория экстракции + Кейл стр.443-452).

Для получения распределительных систем с полярными твердыми фазами (например, силикагель) рекомендуются тройные смеси растворителей, состоящие из неполярного элюента (например, гептана, дихлорметана), сильнополярного компонента (обычно воды) и низкомолекулярного спирта или другого растворителя, смешивающегося и с водой, и с неполярным компонентом. При подборе системы растворителей жидкую фазу можно удалить промыванием колонки, например, дихлорметаном. После этого колонка пригодна для нанесения новой неподвижной фазы.

Для достижения оптимального разделения необходимо, чтобы разделяемые вещества лучше растворялись в неподвижной фазе. Вещества с коэффициентом распределения, близким к единице, при распределительной вымываются с фронтом подвижной фазы. Гидрофильные вещества лучше разделяются при использовании гидрофильных сорбентов (силикагель, крахмал, целлюлоза), а для разделения гидрофобных веществ можно воспользоваться сорбентами для ОФ хроматографии.

АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Макромолекулы БАС отличаются внутри своих индивидуальных групп по физико-химическим свойствам незначительно. Одним из наиболее характерных свойств БАС является способность обратимо связывать другие вещества, называемые в общем случае лигандами или аффинными лигандами (аффинатами). Например, фермент – ингибитор, антиген – антитело. Именно эта способность служит основой для аффинной хроматографии.

Выбор аффинных лигандов осуществляется на основании их биологической природы и биологических свойств разделяемых соединений. Состав элюента подбирается таким образом, чтобы образующийся комплекс, например фермент – ингибитор, на первом этапе элюирования не разрушался, а балластные вещества легко элюировались. Затем, состав элюента меняют таким образом, чтобы разрушить образовавшийся комплекс. Состав элюетна, рН ионная сила также зависят от биологической природы выделяемого соединения.

Требования к носителям.

Стерическая доступность.

Образование комплекса БАС с лигандом, который ковалентно связан с матрицей требует достаточного пространства. Поэтому одно из выжнейших свойств носителей – высокая пористость. Однако, пористость не играет роли при хроматографии полисом, рибосом, интактных клеток. В этом случае все взаимодействия происходят с поверхностными группами сорбента.

Конформация присоединенного лиганда.

Высокая реакционная способность специфических субстратов обусловлена наиболее благоприятной конфигурацией групп субстрата. Поэтому способы привязки лиганда ограничены, т. к. лиганд должен быть привязан той частью молекулы, которая не принимает участия в связывании.

Концентрация БАС, время уравновешивания, скорость потока.

Наносить следует разбавленные растворы БАС, т. к. то связано с диффузией в поры, стерическими затруднениями. Процесс аффинной хроматографии процесс медленный, т. к. необходимо некоторое время для образования комплекса. Поэтому уменьшение числа теоретических тарелок приводит к увеличению эффективности. Иногда поток элюента останавливают на несколько часов и только потом начинают специфическое элюирование.

Неспецифические влияния.

Неспецифическая сорбция балластных веществ возможна вследствие ионного обмена или гидрофобных взаимодействий.